Получение и изучение свойств ДНК грибов.
Автор: Карнаух Михаил, 11 кл.,ГБОУ Гимназия №67, г. Санкт-Петербург,руководитель: Ласточкин В.В.
ДНК – макромолекула, обеспечивающая хранение, передачу из поколения в поколение и реализацию генетической программы развития и функционирования живых организмов. ДНК содержит информацию о структуре различных видов РНК и белков. В клетках эукариот (животных, растений и грибов) ДНК находится в ядре клетки в составе хромосом, а также в некоторых клеточных органоидах (митохондриях и пластидах). Хромосомы являются комплексом скрученной во много раз ДНК с белками, которые поддерживают эту скрученную структуру. Как известно, в состав ДНК входят остатки фосфорной кислоты, сахар – дезоксирибоза и азотистые основания – аденин, тимин, гуанин и цитозин.
Именно благодаря тем важнейшим функциям ДНК, которые я перечислил ранее, возникли такие отрасли как: биотехнология, биоинженерия и т.д. «Главную роль» в этих отраслях играю грибы и бактерии, а точнее их ДНК. Но нас интересует первые, в связи с этим, целью данной работы было сравнить характеристики содержания ДНК в клетках грибов разных систематических группах.
Целью настоящей работы стало изучение содержания ДНК представителей царства грибы и её сравнительный количественный анализ.
В задачи работы входило:
1) изучение состава нуклеопротеидного комплекса
2) выделение ДНК эукариотической клетки грибов
3) сравнение содержания ДНК в клетках грибов
Объекты исследования. Объектами исследования стали мицелий грибов различных систематических групп: боровик обыкновенный (Boletus edulis), подосиновик красный (Leccinum percandidum), подберёзовик обыкновенный (Leccinum scabrum), дрожжи (Saccharomyces cerevisiae), мучнистая роса (Microsphaera berberidis).
Методы исследования. Для изучения комплекса ДНК с белками, называемый нуклеопротеидами, нами был проведен ряд качественных реакций, но для начала нам следовало его получить. Для этого мы кипятили в течение часа дрожжи в 20% серной кислоте.
Было проведено три качественные реакции:
1.Наличие белков мы показали с помощью биуретовой реакции. К смеси был прилит свежеполученный гидроксид меди (II).
2.Наличие в гидролизате азотистых оснований было подтверждено реакцией с раствором аммиака и 1% раствором нитрата серебра.
3.Присутствие сахара было показано с помощью реакции Томмера: к гидролизату было добавлено 30% раствор гидроксида натрия и 7% раствор сульфата меди, а затем смесь была нагрета в пробирке. Для определения содержания ДНК клеточные стенки грибных клеток разрушали с помощью детергента – вещества, используемого при изготовлении моющихся средств, после чего ткань гомогенизировали и экстрагировали. В чистые полипропиленовые пробирки типа Eppendorf объемом 1,5 мл вносили примерно 500 мкл суспензии и 1 мл денатурирующего раствора холодного сахарозного буфера содержащего:32M сахарозы, 5 мМ MgCl2, 0,01 M Tris-HCl буфера (pH 7,6), и 0,1M ZnSО4, 2мM EDTA, 1мM PMSF, 1% тритон X-100 и держали 10 мин при комнатной температуре.
Затем образец центрифугировали при 3000 об/мин, при 4°С в течение 15 мин, сливали супернатант и ресуспензировали ядерный осадок в 400 мкл буфера для протеиназы К и добавляли 20 мкл 10% SDS до конечной концентрации 0,5%. При добавлении SDS происходил лизис ядерной мембраны, ДНК выходило из ядра, и можно визуально наблюдать увеличение вязкости раствора.
После 5 мин инкубации добавляли 5 мкл маточного раствора протеиназы К с концентрацией 20 мг/мл (конечная концентрация — 250 мкг/мл). Инкубацию с протеиназой К проводили в течение 12 ч при 37°С. По окончании инкубации добавляли 400 мкл забуференного фенола (Sambrook et al., 1989), осторожно перемешивали в течение 10 мин и центрифугировали 5 мин при 5000 об/мин.
После разделения фаз ДНК находящуюся в верхней водной фазе, переносили в другую чистую пробирку и добавили 400 мкл смеси фенол:хлороформ (1:1), перемешивали в течение 5 мин и центрифугировали 5 мин при 5000 об/мин. Вторично верхнюю водную фазу перенесли в другую пробирку и добавили 400 мкл хлороформа. Центрифугирование повторяли. Третий раз верхнюю водную фазу перенесли в чистую пробирку, и к раствору ДНК добавили последовательно 40 мкл 3 М ацетата Na (1/10 объема) и 800 мкл охлажденного 96% этанола (2 объема). Осторожно перемешивали, наблюдая преципитацию ДНК. Образец центрифугировали при 12000 об/мин в течение 10 мин, а затем промывали осадок 1 мл 70% этанола для удаления соли, используемой при переосаждении ДНК. Образец повторно центрифугировали при 12000 об/мин в течение 5 мин. Осадок высушивали при комнатной температуре до исчезновения запаха спирта и растворяли ДНК в ТЕ-буфере (в течение ночи).
Определение содержания ДНК осуществляли на спектрофотометре UNICO при 260 и 280 нм c последующим определением содержания ДНК по формуле С= Е260 – Е280/0,19.
Результаты исследования. На первом этапе нами было доказано, что полученное вещество – ДНК грибных клеток. Кипячение привело к гидролизу оболочек нуклеопротеидов и ДНК. В результате образовалась смесь, содержащая, помимо остатков клеточных структур, белки, дезоксирибозу, азотистые основания и фосфорную кислоту.
При биуретовой реакции (рис. 1) раствор окрасился в фиолетовый цвет, что подтверждает наличие в смеси белков.
При добавлении в гидролизат аммиака и 1% раствора нитрата серебра, этом образовался осадок, являющийся серебряными соединениями аденина и гуанина.
Результатом реакции Томмера (рис. 2) было слабое желтое окрашивание раствора вследствие образования гидрата окиси меди II и окиси меди I. Это происходит за счет восстановления меди (II) в медь (I) под действием сахаров.
Результаты проведённой работы показали, что содержание ДНК в грибных клетках разных систематических групп несколько различаются (рис. 3).
Так, наибольшее количество ДНК наблюдалось в клетках паразитического мучнисто росяного гриба, что связано, по-видимому, с большим количеством генов, участвующих в процессе адаптации гриба к растению-хозяину. Наоборот, наименьшее количество ДНК в клетках дрожжей делает эти грибы удобным модельным объектом для изучения генома и свойств, грибных клеток.
Выводы:
1. Изучение состава нуклеопротеидного комплекса выявило, что он действительно состоит из белков, азотистых оснований и сахаров.
2. В клетках грибов содержится различное количество ДНК.
3. Максимальное содержание ДНК обнаружено в клетках паразитического гриба Microsphaera berberidis, а наименьшее – в клетках дрожжей.
Источники информации в литературе:
1. Альбертс Б., Брей Д., Льюис Дж. и др. Молекулярная био-логия клетки в 3-х томах. — М.: Мир, 1994. — 1558 с.
2. 2. Горленко М.В и др. Грибы СССР-М:1980
3. 3. Захаров А.Ф., Бенюш В.А., Кулешов Н.П., Барановская Л.И. Хромосомы человека. Атлас. — М.: Медицина, 1982. — 263 с.